Histone deacetylase enzymes as potential drug targets of Neglected Tropical Diseases caused by cestodes

Cestode parasites cause neglected diseases, such as echinococcosis and cysticercosis, which represent a significant problem in human and animal health. Benzimidazoles and praziquantel are the only available drugs for chemotherapy and it is therefore important to identify new alternative drugs against cestode parasites. Histone deacetylases (HDACs) are validated drug targets for the treatment of cancer and other diseases, including neglected diseases. However, knowledge of HDACs in cestodes is very scarce. In this work, we investigated cestode HDACs as potential drug targets to develop new therapies against neglected diseases caused by cestodes. Here we showed the full repertoire of HDAC coding genes in several members of the class Cestoda. Between 6 and 7 zinc-dependent HDAC coding genes were identified in the genomes of species from Echinococcus, Taenia, Mesocestoides and Hymenolepis genera. We classified them as Class I and II HDACs and analyzed their transcriptional expression levels throughout developmental stages of Echinococcus spp. We confirmed for the first time the complete HDAC8 nucleotide sequences from Echinococcus canadensis G7 and Mesocestoides corti. Homology models for these proteins showed particular structural features which differentiate them from HDAC8 from Homo sapiens. Furthermore, we showed that Trichostatin A (TSA), a pan-HDAC inhibitor, decreases the viability of M. corti, alters its tegument and morphology and produces an increment of the total amount of acetylated proteins, including acetylated histone H4. These results suggest that HDAC from cestodes are functional and might play important roles on survival and development. The particular structural features observed in cestode HDAC8 proteins suggest that these enzymes could be selectively targeted. This report provides the basis for further studies on cestode HDAC enzymes and for discovery of new HDAC inhibitors for the treatment of neglected diseases caused by cestode parasites.Fil: Vaca, Hugo Rolando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Celentano Stanic, Ana Maria Luisa Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Macchiaroli, Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Kamenetzky, Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Camicia, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Rosenzvit, Mara Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentin

Characterization of a new serotonergic g-protein coupled receptor from cestodes: new potential target for drugs against neglected tropical diseases

Abstract/Resumen: Echinococcus canadensis is aplatyhelminth parasite that belongs to the class Cestoda and isthe etiological agent of the Hydatid disease, a neglected diseasethat affects public health and the economy in Argentina andworldwide. Currently, the treatment for echinococcosis inhumans relies on benzimidazoles. However, the emergence ofresistant parasites, makes the discovery of new anthelminticdrugs an imperative need. To tackle this problem, we propose tocharacterize G-protein coupled receptors from cestodes as newpharmacological targets. In our previous work (1), we found thatserotonergic GPCRs (5-HT GPCRs) are of major importance incestode movement and showed distinctive pharmacology. Theaim of this work was to study the function of a new 5-HT GPCRfrom Echinococcus canadensis. Similar sequences were alsofound in another cestode species. Bioinformatics analysessuggest the existence of genes encoding for 5-HT GPCRs and thisinformation was used for the design of primers. New cDNA wassynthesized using RNA extracted from protoscoleces of pig originas a template for PCR reactions. The amplificated cDNA codingfor the serotonergic gene was cloned, sequenced and finally usedfor transient transfections in HEK293 cells. Calcium levels weremeasured using a fluorescent imaging plate reader (FLIPR) assay(2). When the cell line was transfected with a gene encoding forthe cestode receptor, the calcium levels increased only in thepresence of serotonin but not with of other ligands liketryptamine, tyramine, octopamine, acetylcholine, histidine ordopamine. The dataset confirms the bioinformatics analysesshowing that the cloned gene encodes for a new 5-HT GPCR conserved in cestodes. The cloning strategy followed by sequencing and expression in HEK cells revealed a new 5-HT GPCR. The results obtained confirm bioinformatics predictions and will be tested as a target for cestocidal drugs.Fil: Camicia, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Park, Sang Kyu. Medical College Of Wisconsin; Estados UnidosFil: Vaca, Hugo Rolando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Woodhouse, Kristen. Medical College Of Wisconsin; Estados UnidosFil: Celentano, Ana María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: López Aventrani, Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Rosenzvit, Mara Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Marchant, Jonathan S.. Medical College Of Wisconsin; Estados UnidosLXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; LI Reunión Anual de la Asociación Argentina de Farmacología Experimental; XXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biología; XXXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; IX Reunión Anual de la Asociación Argentina de Nanomedicinas y VI Reunión Científica Regional de la Asociación Argentina de Ciencia y Tecnología de Animales de LaboratorioMar del PlataArgentinaSociedades de BiocienciasSociedad Argentina de Investigación ClínicaAsociación Argentina de Farmacología ExperimentalSociedad Argentina de BiologíaSociedad Argentina de ProtozoologíaAsociación Argentina de NanomedicinasAsociación Argentina de Ciencia y Tecnología de Animales de Laboratori

Characterization of a new type of neuronal 5-HT G-protein coupled receptor in the cestode nervous system

Cestodes are platyhelminth parasites with a wide range of hosts that cause neglected diseases. Neurotransmitter signaling is of critical importance for these parasites which lack circulatory, respiratory and digestive systems. For example, serotonin (5-HT) and serotonergic G-protein coupled receptors (5-HT GPCRs) play major roles in cestode motility, development and reproduction. In previous work, we deorphanized a group of 5-HT7 type GPCRs from cestodes. However, little is known about another type of 5-HT GPCR, the 5-HT1 clade, which has been studied in several invertebrate phyla but not in platyhelminthes. Three putative 5-HT GPCRs from Echinococcus canadensis, Mesocestoides vogae (syn. M. corti) and Hymenolepis microstoma were cloned, sequenced and bioinformatically analyzed. Evidence grouped these new sequences within the 5-HT1 clade of GPCRs but differences in highly conserved GPCR motifs were observed. Transcriptomic analysis, heterologous expression and immunolocalization studies were performed to characterize the E. canadensis receptor, called Eca-5-HT1a. Functional heterologous expression studies showed that Eca-5-HT1a is highly specific for serotonin. 5-Methoxytryptamine and αmethylserotonin, both known 5-HT GPCR agonists, give stimulatory responses whereas methysergide, a known 5-HT GPCR ligand, give an antagonist response in Eca-5-HT1a. Mutants obtained by the substitution of key predicted residues resulted in severe impairment of receptor activity, confirming that indeed, these residues have important roles in receptor function. Immunolocalization studies on the protoscolex stage from E. canadensis, showed that Eca-5-HT1a is localized in branched fibers which correspond to the nervous system of the parasite. The patterns of immunoreactive fibers for Eca-5-HT1a and for serotonin were intimately intertwined but not identical, suggesting that they are two separate groups of fibers. These data provide the first functional, pharmacological and localization report of a serotonergic receptor that putatively belongs to the 5-HT1 type of GPCRs in cestodes. The serotonergic GPCR characterized here may represent a new target for antiparasitic intervention.Fil: Camicia, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Patología. Centro de Patología Experimental; ArgentinaFil: Vaca, Hugo Rolando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Park, Sang-Kyu. Medical College Of Wisconsin; Estados UnidosFil: Bivona, Augusto Ernesto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Naidich, Ariel. Dirección Nacional de Institutos de Investigación. Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas; ArgentinaFil: Preza, Matias. Universidad de la República; UruguayFil: Koziol, Uriel. Universidad de la Republica; UruguayFil: Celentano Stanic, Ana Maria Luisa Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Marchant, Jonathan S.. Medical College Of Wisconsin; Estados UnidosFil: Rosenzvit, Mara Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentin

The potential for histone deacetylase (HDAC) inhibitors as cestocidal drugs

Background: Echinococcosis and cysticercosis are neglected tropical diseases caused by cestode parasites (family Taeniidae). Not only there is a small number of approved anthelmintics for the treatment of these cestodiases, but also some of them are not highly effective against larval stages, such that identifying novel drug targets and their associated compounds is critical. Histone deacetylase (HDAC) enzymes are validated drug targets in cancers and other diseases, and have been gaining relevance for developing new potential anti-parasitic treatments in the last years. Here, we present the anthelmintic profile for a panel of recently developed HDAC inhibitors against the model cestode Mesocestoides vogae (syn. M. corti).Methodology/principal findings: Phenotypic screening was performed on M. vogae by motility measurements and optical microscopic observations. Some HDAC inhibitors showed potent anthelmintic activities; three of them-entinostat, TH65, and TH92 -had pronounced anthelmintic effects, reducing parasite viability by ~100% at concentrations of ≤ 20 μM. These compounds were selected for further characterization and showed anthelmintic effects in the micromolar range and in a time- and dose-dependent manner. Moreover, these compounds induced major alterations on the morphology and ultrastructural features of M. vogae. The potencies of these compounds were higher than albendazole and the anthelmintic effects were irreversible. Additionally, we evaluated pairwise drug combinations of these HDAC inhibitors and albendazole. The results suggested a positive interaction in the anthelmintic effect for individual pairs of compounds. Due to the maximum dose approved for entinostat, adjustments in the dose regime and/or combinations with currently-used anthelmintic drugs are needed, and the selectivity of TH65 and TH92 towards parasite targets should be assessed.Conclusion, significance: The results presented here suggest that HDAC inhibitors represent novel and potent drug candidates against cestodes and pave the way to understanding the roles of HDACs in these parasites.Fil: Vaca, Hugo Rolando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Producción, Sanidad y Ambiente - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Producción, Sanidad y Ambiente; ArgentinaFil: Celentano, Ana M.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología; ArgentinaFil: Toscanini, María Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Heimburg, Tino. No especifíca;Fil: Ghazy, Ehab. No especifíca;Fil: Zeyen, Patrik. No especifíca;Fil: Hauser, Alexander Thomas. Albert Ludwigs University of Freiburg; AlemaniaFil: Oliveira, Guilherme. Instituto Tecnológico Vale.; BrasilFil: Elissondo, María Celina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Producción, Sanidad y Ambiente - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Producción, Sanidad y Ambiente; ArgentinaFil: Jung, Manfred. Albert Ludwigs University of Freiburg; AlemaniaFil: Sippl, Wolfgang. No especifíca;Fil: Camicia, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Rosenzvit, Mara Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentin

Evaluasi Program Penyediaan Air Minum Dan Sanitasi Berbasis Masyarakat (Pamsimas) Di Kecamatan Tembalang

Pembangunan tidak lain merupakan suatu proses Perubahan yang berlangsung secara sadar, terencana dan berkelanjutan dengan sasaran utamanya adalah untuk meningkatkan kesejahteraan hidup manusia. Salah satu pembangunan yang menjadi perhatian adalah kebutuhan air bersih dan sanitasi. Pamsimas merupakan salah satu bentuk solusi dari kurangnya air bersih dan sanitasi di Indonesia. Tetapi pelaksanaan Pamsimas masih belum optimal, tidak terkecuali pelaksanaan di Kecamatan Tembalang Kota Semarang. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi Program Penyediaan Air Minum dan Sanitasi Berbasis Masyarakat (Pamsimas) di Kecamatan Tembalang. Dalam evaluasi ini digunakan enam kriteria evaluasi yaitu efisiensi, efektivitas, kecukupan, perataan, responsivitas dan ketepatan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa Pamsimas di Kecamatan Tembalang sudah efektif dalam memenuhi kebutuhan air bersih dan sanitasi. Tetapi masih ditemui kekurangan, seperti kurang meratanya pembangunan tower air dan perpipaan Pamsimas, selain tidak merata masih banyak warga miskin yang masih belum dapat mendapatkan Pamsimas. Rekomendasi untuk meningkatkan perataan pembangunan Pamsimas dapat dilakukan pada saat musyawarah penentuan prioritas pembangunan dilakukan oleh seluruh elemen pelaksana Pamsimas, hal ini agar tercipta keadilan dan pemerataan pada pembangunan karena diawasi langsung oleh semua pihak yang terkait

Identification and characterization of sirtuin enzymes in cestodes and evaluation of sirtuin inhibitors as new cestocidal molecules

Anti-parasitic treatment of neglected tropical diseases caused by cestodes such as echinococcosis and cysticercosis relies on a small number of approved anthelmintic drugs. Furthermore, the treatment is usually prolonged and often partially effective and not well tolerated by some patients. Therefore, the identification of novel drug targets and their associated compounds is critical. In this study, we identified and characterised sirtuin enzymes in cestodes and evaluated the cestocidal potential of sirtuin inhibitors as new cestocidal molecules. Sirtuins are a highly conserved family of nicotinamide-adenine dinucleotide-lysine deacylases involved in multiple cellular functions. Here, we described the full repertoire of sirtuin-encoding genes in several cestode species. We identified six sirtuin-encoding genes that were classified into sirtuins Class I (SIRT1, SIRT2, and SIRT3), Class III (SIRT5), and Class IV (SIRT6 and SIRT7). In Echinococcus spp., sirtuin genes showed transcriptional expression throughout several developmental stages, sirtuin 2 (SIRT2) being the most expressed. To evaluate the potential of sirtuin inhibitors as new cestocidal molecules, we determined the in vitro effect of several Class I sirtuin inhibitors by motility assay. Of those, the selective SIRT2 inhibitor Mz25 showed a strong cestocidal activity in Mesocestoides vogae (syn. Mesocestoides corti) tetrathyridia at various concentrations. The Mz25 cestocidal activity was time- and dose-dependent with a half-maximal inhibitory concentration value significantly lower than that of albendazole. Additionally, Mz25 induced extensive damage in the general morphology with marked alterations in the tegument and ultrastructural features. By homology modelling, we found that cestode SIRT2s showed a high conservation of the canonical sirtuin structure as well as in the residues related to Mz25 binding. Interestingly, some non-conservative mutations were found on the selectivity pocket (an Mz25-induced structural rearrangement on the active site), which represent a promising lead for developing selective cestode SIRT2 inhibitors derived from Mz25. Nevertheless, the Mz25 molecular target in M. vogae is unknown and remains to be determined. This report provides the basis for further studies of sirtuins to understand their roles in cestode biology and to develop selective sirtuin inhibitors to treat these neglected tropical diseases.Fil: Vaca, Hugo Rolando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Celentano Stanic, Ana Maria Luisa Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Toscanini, María Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Thomas Hausen, Alexander. Albert Ludwigs University of Freiburg; AlemaniaFil: Macchiaroli, Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biociencias, Biotecnología y Biología Traslacional; ArgentinaFil: Cuestas, María Luján. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Nusblat, Alejandro David. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Sippl, Wolfgang. Martin-Luther-University of Halle-Wittenberg; AlemaniaFil: Elissondo, María Celina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Producción, Sanidad y Ambiente - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Producción, Sanidad y Ambiente; ArgentinaFil: Jung, Manfred. Albert Ludwigs University of Freiburg; AlemaniaFil: Camicia, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Rosenzvit, Mara Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentin

Colorectal cancer development is affected by the ECM molecule EMILIN-2 hinging on macrophage polarization via the TLR-4/MyD88 pathway

Background Colorectal cancer is one of the most frequent and deadly tumors. Among the key regulators of CRC growth and progression, the microenvironment has emerged as a crucial player and as a possible route for the development of new therapeutic opportunities. More specifically, the extracellular matrix acts directly on cancer cells and indirectly affecting the behavior of stromal and inflammatory cells, as well as the bioavailability of growth factors. Among the ECM molecules, EMILIN-2 is frequently down-regulated by methylation in CRC and the purpose of this study was to verify the impact of EMILIN-2 loss in CRC development and its possible value as a prognostic biomarker. Methods The AOM/DSS CRC protocol was applied to Emilin-2 null and wild type mice. Tumor development was monitored by endoscopy, the molecular analyses performed by IHC, IF and WB and the immune subpopulations characterized by flow cytometry. Ex vivo cultures of monocyte/macrophages from the murine models were used to verify the molecular pathways. Publicly available datasets were exploited to determine the CRC patients' expression profile; Spearman's correlation analyses and Cox regression were applied to evaluate the association with the inflammatory response; the clinical outcome was predicted by Kaplan-Meier survival curves. Pearson correlation analyses were also applied to a cohort of patients enrolled in our Institute. Results In preclinical settings, loss of EMILIN-2 associated with an increased number of tumor lesions upon AOM/DSS treatment. In addition, in the early stages of the disease, the Emilin-2 knockout mice displayed a myeloid-derived suppressor cells-rich infiltrate. Instead, in the late stages, lack of EMILIN-2 associated with a decreased number of M1 macrophages, resulting in a higher percentage of the tumor-promoting M2 macrophages. Mechanistically, EMILIN-2 triggered the activation of the Toll-like Receptor 4/MyD88/NF-kappa B pathway, instrumental for the polarization of macrophages towards the M1 phenotype. Accordingly, dataset and immunofluorescence analyses indicated that low EMILIN-2 expression levels correlated with an increased M2/M1 ratio and with poor CRC patients' prognosis. Conclusions These novel results indicate that EMILIN-2 is a key regulator of the tumor-associated inflammatory environment and may represent a promising prognostic biomarker for CRC patients

The Echinococcus canadensis (G7) genome: A key knowledge of parasitic platyhelminth human diseases

Background: The parasite Echinococcus canadensis (G7) (phylum Platyhelminthes, class Cestoda) is one of the causative agents of echinococcosis. Echinococcosis is a worldwide chronic zoonosis affecting humans as well as domestic and wild mammals, which has been reported as a prioritized neglected disease by the World Health Organisation. No genomic data, comparative genomic analyses or efficient therapeutic and diagnostic tools are available for this severe disease. The information presented in this study will help to understand the peculiar biological characters and to design species-specific control tools. Results: We sequenced, assembled and annotated the 115-Mb genome of E. canadensis (G7). Comparative genomic analyses using whole genome data of three Echinococcus species not only confirmed the status of E. canadensis (G7) as a separate species but also demonstrated a high nucleotide sequences divergence in relation to E. granulosus (G1). The E. canadensis (G7) genome contains 11,449 genes with a core set of 881 orthologs shared among five cestode species. Comparative genomics revealed that there are more single nucleotide polymorphisms (SNPs) between E. canadensis (G7) and E. granulosus (G1) than between E. canadensis (G7) and E. multilocularis. This result was unexpected since E. canadensis (G7) and E. granulosus (G1) were considered to belong to the species complex E. granulosus sensu lato. We described SNPs in known drug targets and metabolism genes in the E. canadensis (G7) genome. Regarding gene regulation, we analysed three particular features: CpG island distribution along the three Echinococcus genomes, DNA methylation system and small RNA pathway. The results suggest the occurrence of yet unknown gene regulation mechanisms in Echinococcus. Conclusions: This is the first work that addresses Echinococcus comparative genomics. The resources presented here will promote the study of mechanisms of parasite development as well as new tools for drug discovery. The availability of a high-quality genome assembly is critical for fully exploring the biology of a pathogenic organism. The E. canadensis (G7) genome presented in this study provides a unique opportunity to address the genetic diversity among the genus Echinococcus and its particular developmental features. At present, there is no unequivocal taxonomic classification of Echinococcus species; however, the genome-wide SNPs analysis performed here revealed the phylogenetic distance among these three Echinococcus species. Additional cestode genomes need to be sequenced to be able to resolve their phylogeny.Fil: Maldonado, Lucas Luciano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Assis, Juliana. Fundación Oswaldo Cruz; BrasilFil: Gomes Araújo, Flávio M.. Fundación Oswaldo Cruz; BrasilFil: Salim, Anna C. M.. Fundación Oswaldo Cruz; BrasilFil: Macchiaroli, Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Cucher, Marcela Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Camicia, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Fox, Adolfo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Rosenzvit, Mara Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Oliveira, Guilherme. Instituto Tecnológico Vale; Brasil. Fundación Oswaldo Cruz; BrasilFil: Kamenetzky, Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentin

Characterization of amino acid transporters from Echinococcus granulosus

Echinococcus granulosus es un pequeño parásito cestode cuyo estadío larval causa la equinococcosis quística o hidatidosis. El objetivo de esta tesis fue analizar el transporte de aminoácidos en el estadío de metacestode y diseccionar los componentes moleculares involucrados en el mismo. Los análisis bioinformáticos realizados han mostrado que en Echinococcus spp. los transcriptos codificantes para transportadores de aminoácidos de la familia DAACS (transportadores de aminoácidos/ dicarboxilatos y catión) se encuentran entre los más representados, siendo los transportadores de aminoácidos excitatorios los más expresados dentro de los miembros de esta familia. Los ensayos de transporte efectuados en quistes hidatídicos infértiles indican que la incorporación de glutamato se daría mediante difusión simple, lo cual sugiere que dicho aminoácido podría ser sintetizado endógenamente. Este resultado estaría en concordancia con el hallazgo bioinformático de genes codificantes para enzimas que intervendrían en la síntesis de novo del aminoácido glutamato. Los análisis transcriptómicos sugieren que habría un aumento muy importante en la expresión de transportadores a nivel del parásito adulto con respecto a la forma lavaria, lo cual sugiere que en el estadío adulto la incorporación de glutamato en forma mediada podría ser esencial. Así mismo, en el protoescólex se han identificado ADNs copia codificantes para transportadores de aminoácidos que podrían estar involucrados en dicho transporte y se han denominado egat1-4. Con el fin de caracterizarlos, se han clonado y determinado las secuencias completas de los ADNs copia correspondientes y se ha hallado que poseen similaridad de secuencia y estructura con miembros de la familia DAACS. Los ensayos de hibridación in situ mostraron que el mensajero de egat1 se localiza en la zona tegumentaria del protoescólex y el correspondiente de egat3 en células del parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. Los anticuerpos contra fragmentos de EgAT1 y EgAT2 reconocieron proteínas en extractos del metacestode en ensayos de Western-blot. Se ha observado que EgAT1 se localiza en el subtegumento del protoescólex, ventosas, almohadilla rostelar y en fibras internas. EgAT1 también se localiza en capa germinal y en el subtegumento del parásito adulto. Por otro lado, EgAT2 se localiza en el parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. La diferente expresión espacial y temporal de los transportadores de aminoácidos analizados sugiere que cada uno de ellos cumpliría con las distintas necesidades de aminoácidos en diferentes territorios celulares y/o estadíos del ciclo de vida del parásito. EgAT1 se logró expresar en células de mamífero y los estudios funcionales efectuados en dichas células mostraron un pequeño pero significativo nivel de transporte de glutamato. La expresión de los transportadores a lo largo del ciclo de vida del parásito, su localización en estructuras claves para la interacción con el hospedador, su capacidad aunque limitada de incorporar glutamato, junto a las diferencias de estructura primaria y secundaria con sus ortólogos en mamíferos sugieren que estas moléculas podrían ser blancos de drogas contra la hidatidosis, además de proveer las bases moleculares para profundizar en la biología del parásito en lo que respecta al intercambio de metabolitos con el hospedador.Echinococcus granulosus is a small parasitic cestode whose larval stage causes cystic echinococcosis or hydatidosis. The aim of this thesis was to analyse the amino acid transport in the metacestode stage and characterise the involved molecules. Bioinformatic analysis performed in Echinococcus spp showed that the transcripts coding for amino acid transporters of the DAACS family (Dicarboxylate/Amino Acid Na+ and/or H+ Cation Symporter family) are among the more represented, being the excitatory amino acid transporters the more expressed among the members of this family. Transport assays have shown that infertile hydatid cysts incorporate the amino acid glutamate from the external milleu by simple difussion. This is in concordance with the bioinformatic finding of the genes encoding enzymes possibly involved in glutamate synthesis. However, the transcriptomic analyses suggest an important increase in the expression levels of amino acids transporters in the adult form and this could imply that glutamate uptake is essential in the adult stage. Also, in the protoscolex stage, cDNAs encoding amino acid transporters were identified and named egat1-4. The corresponding cDNAs were cloned and their sequences were determined. The bioinformatic analyses revealed that they have sequence and structure similarity to DAACS family members. The in situ hybridization labelling indicates the distribution of egat1 mRNA throughout the tegument and egat3 mRNA in parenchimal cells of the protoscolex as well as in buds of the germinal layer. Monospecific polyclonal antibodies against the hydrophilic portions of EgAT1-3 were obtained from which only anti-Egat1 and anti-EgAT2 recognised metacestode proteins by Western-blot. These antibodies showed that EgAT1 protein is localized in the subtegumental region of the metacestode, particularly around suckers and rostellum of protoscoleces and in internal fibers compatible with nervous or muscular structures. EgAT1 was also localised in the germinal layer of the metacestode and in the subtegumental region of the adult worm. EgAT2 was localised in the parenchima of the protoscolex and in buds of the germinal layer. The differencial spatial and temporal expression of the amino acid transporters analysed in this thesis, suggest that each of them fulfil the specific amino acid requirements of the different cellular territories and/or life cycle stages. In addition, EgAT1 was expressed in mammal cells in which functional studies were performed. These studies showed a low but significant glutamate transport level. The low level of transport detected in this system could be due to the difficulty of the mammal cells to get the correct folding, subcellular location and post-translational modifications of the heterologous protein. The expression of the E. granulosus amino acid transporters all along the life cycle, their localisation in organs like suckers and rostellum, which are of major importance for the survival in the final host, and in buds of the germinal layer which give rise to protoscoleces, together with the capacity to transport glutamate and the structural differences with their mammal orthologous, suggest that these molecules could be amenable target for antihelmintics. The results obtained in this thesis could also help to understand the molecular basis of the metabolites interchange between the parasite and their hosts.Fil:Camicia, Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Hidatidosis retroperitoneal secundaria a quiste hidatídico de localización hepática

La hidatidosis es una enfermedad de distribución mundial, producida por un platelminto parásito del género Echinococcus. El caso que se presenta corresponde a una paciente con una tumoración fluctuante en el espacio retroperitoneal lumbar, secundaria a un quiste hepático. El diagnóstico inicial de certeza fue dado por el hallazgo de ganchos rostelares de protoescólices en el líquido aspirado de un absceso. Este trabajo describe el cuadro clínico, el diagnóstico y el tratamiento médico-quirúrgico de esta paciente. Se analiza cómo la elaboración de un diagnóstico certero requiere de un análisis adecuado de los antecedentes epidemiológicos, las manifestaciones clínicas, los estudios de imágenes y las pruebas de laboratorio, ya que el conjunto de estos datos confirman el caso.Retroperitoneal hydatidosis secondary to hepatic hydatid cyst. Hydatid disease is a worldwide zoonosis. It is caused by a parasitic platyhelminth of the genus Echinococcus. We present a patient with a fluctuating lumbar tumor in the retroperitoneal space, secondary to a hepatic cyst. The initial diagnosis was made by identification of rostellar hooks from protoscoleces in the fluid aspirated from the abscess. We herein describe the clinical manifestations, diagnosis and medical and surgical treatment of this unusual case and conclude that the development of an accurate diagnosis requires a proper analysis of the patient’s epidemiological history, clinical manifestations, imaging studies and laboratory tests. A multidisciplinary approach and differential diagnosis is paramount to be able to establish a cause of the disease to deliver appropriate treatment